Rođena je 1877. godine u vojvođanskom selu Mošorinu, kao ćerka opštinskog beležnika Danila Sekulića. Detinjstvo je provela u Rumi, Zemunu i Novom Sadu, u kojem je pohađala Višu devojačku školu. Obrazovanje je, takođe, sticala i u Somboru, gde se školovala na Srpskoj preparandiji, a u ovom gradu je objavila i svoj prvi rad u školskom časopisu „Školski list“, pod nazivom „Šta su Srbinu gusle?“.
Iako se posebno isticala u književnosti, kao i po znanju pet svetskih jezika, koje je naučila od svog oca, bila je uspešna i u filozofiji i prirodnim naukama, tako da je 1892. godine diplomirala matematiku i prirodne nauke na Pedagoškoj školi u Budimpešti, a kasnije je u Nemačkoj i doktorirala.
Po završetku studija, Isidora je najpre radila kao učiteljica matematike, a zatim je je predavala i francusku književnost u Pančevu, Beogradu, Skoplju i Šapcu.
Nakon što je iste godine ostala bez oca i brata, veliki deo svog vremena je provodila na groblju, te se tamo upoznaje sa grobarom Nikolom, zahvaljujući čijim je pričama nastalo jedno od njenih najpoznatijih dela -„Hronika palanačkog groblja“. Naime, grobar je Isidori pričao o životima ljudi koji su bili sahranjeni na zemunskom groblju, a ona je sve te priče beležila u svesku, koju je stalno nosila sa sobom.
Ostala je upamćena i kao svetska putnica, budući da je tokom svog života posetila brojne države, među kojima su Engleska, Francuska, Švedska, Nemačka, Italija i Norveška. Posebno joj se svidela skandinavska zemlja, koja ju je očarala prirodnim lepotama, koje je zabeležila i opisala u putopisima „Pisma iz Norveške“.
Tokom svog života pisala je prozu, pripovetke, eseje, romane, književne kritike i putopise. Takođe, prevodila je dela raznih svetskih pisaca, a posebno važnu ulogu u njenoj karijeri predstavljaju kritike i eseji s temama iz Francuske i Engleske sakupljeni u knjigama „Teme“ i „Analitički trenuci“. Njeni radovi su objavljivani u raznim časopisima kao što su „Srpski književni glasnik“, „Letopis matice srpske“, „Brankovo kolo“, „Ženski pokret“ i u mnogim drugim.
Isidora Sekulić je bila članica raznih udruženja, pa je često organizovala druženja u svom stanu, gde bi gosti raspravljali o književnosti i umetnosti. Zahvaljujući svom obrazovanju i radu, uživala je status najobrazovanije Srpkinje tog vremena, te je 1939. godine postala dopisnica Srpske kraljevske akademije nauka, a deset godina kasnije i prva žena članica Srpske akademije nauka i umetnosti, čiji ju je odbor akademika ove ustanove uvrstio na spisak 100 najznačajnijih Srba.
Istovremeno, bila je članica brojnih ženskih organizacija, njihova istaknuta predstavnica na raznim konvencijama, a izabrana je i za sekretara Upravnog odbora Međunarodnog saveta žena. Zatim, jedna je od osnivača Udruženja učitelja srednjih stručnih škola, a nakon Drugog svetskog rata postala je član odbora Jugoslovenske antifašističke ženske fronte.
Isidora Sekulić je umrla 1958. godine u Beogradu, a sahranjena je na Topčiderskom groblju, dok joj je 2015. godine na Topčideru podignut spomenik. U znak zahvalnosti, ali i sećanja na njeno stvaralaštvo i doprinos srpskoj kulturi, svake godine se na naučnom skupu izdaje zbornik radova „Isidorijana“, te se dodeljuje književna nagrada „Isidora Sekulić“, dok škole u Novom Sadu i Beogradu nose njeno ime. Takođe, prikazana je TV drama o njenom životu, a Uglješa Šajtinac je dramatizovao njen roman „Đakon bogorodičine crkve”.
Povodom njenog 80. rođendana, Udruženje književnika Srbije organizovalo je svečanu akademiju, na kojoj je predsednik Republike odlikuje Ordenom rada prvog reda, a Nolit objavljuje izbor njenih eseja „Mir i nemir“.
